摘要：目的利用聚醚砜中空纤维膜对脉络宁注射液生产废水的小分子药效物质进行富集。方法以共性高分子（蛋白质、鞣质、淀粉、果胶）截留率和小分子药效物质绿原酸的渗透率为考察指标，优选出超滤膜过程停止时间和膜型号，进而采用Box-Behnken中心组合设计建立数学模型，优化出超滤膜过程的最佳工艺参数。结果在共性高分子截留率中，影响因素A（温度）＞B（错流压差）＞C（进料速率），并且与温度呈负相关性；在绿原酸透过率中，影响因素A（温度）＞B（错流压差）＞C（进料速率），并且在温度与速率一定时，绿原酸透过率与错流压差存在“∩”型关系。优化工艺结果为药液温度35℃，进料体积流量为mL/min，错流压差15.0psi（1psi＝6.kPa），工艺验证绿原酸透过率为（91.±0.）%，高分子截留率为（80.±2.）%，综合评分为（85.±1.）%，RSD为0.46%，与预测工艺偏差较小。结论中空纤维膜对于生产废水中的小分子药效物质有良好的渗透率，并对共性大分子有优良的截留效果，是一种可持续的、绿色资源化利用方式。
脉络宁注射液由金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂生产，由玄参、石斛、牛膝、金银花4味药材经水提、醇沉等工艺处理后而得，是防治血栓性闭塞性血管病的中药复方注射液[1-2]，为国家基本药物目录所保留的8个中药注射液品种之一，医院急诊必备药品。在生产过程中，药材存在着浸泡、洗药、蒸煮、提取、离心过滤等环节，而这些环节主要以水作为载体，因此，必然会产生大量的液体废弃物，对其进行处置与回收、利用其中的资源性物质，对于保护生态环境和提高资源利用度都意义重大[3-6]。实验室前期研究发现，脉络宁注射液生产废水中含有以绿原酸为代表的资源性化学成分，其中亦含有微量的咖啡酸、β-蜕皮甾酮等小分子，并伴有果胶、淀粉、鞣质、蛋白质等共性高分子的复杂混合体系，具有浊度大、处理强度高的特点，属于存在一定经济效益的“废弃物”。
膜科学技术是随着现代工业的发展和分离科学不断进步而演化出的一种新型的分离技术，其基本原理是在外界给予能量（包括压力差、浓度差、电位差等）时对混合物中溶质进行分离、富集、浓缩、纯化。与传统分离技术相比，膜分离技术具有过程简单、节能高效、适宜工业化生产的要求、对溶质的结构基本不改变等一系列优点[7-9]。因而，膜分离技术在石油化工、污水处理、食品加工、医药生产、海水淡化等行业均具有一定的适用性，膜分离技术也被认为是20世纪末至21世纪中期最有发展前途的高新技术之一。
膜分离技术具有节约、清洁、安全的优势，其在中药废弃物的复杂体系上的应用，不仅是中药废弃物资源化的重要选择之一，更是符合建设资源节约型与环境友好型社会的长期需求。本实验在前期实验的初步数据基础上，以温度、错流压差、进料速率为影响因子，应用Box-Behnken中心组合设计建立数学模型，以药效物质绿原酸的有效富集和无效成分的高效截留为考察指标，建立绿原酸富集方法，从而为脉络宁注射液生产废水资源化利用提供实验依据。
1仪器与材料
1.1仪器
聚醚砜中空纤维膜，实验室定制，天津爱生膜过滤技术有限公司，相对分子质量、、，膜面积0.12m2；兰格WT-1F恒流泵，兰格恒流泵有限公司；Agilent高效液相色谱仪以及ZorbaxSB-C18色谱柱，美国安捷伦科技有限公司；ThermoBioMate3S紫外-可见光分光光度计、ThermoMultiskanFC酶标仪与Thermo低温高速离心机，美国赛默飞世尔科技有限公司；梅特勒-托利多MS-电子天平，美国梅特勒-托利多国际贸易有限公司；EPED超纯水系统，南京易普达易科技发展有限公司；SartoriuspH计PB-10，德国赛多利斯贸易有限公司；SHB-III型循环水式真空泵，南京文尔仪器设备有限公司；DDSJ-A数显电导仪，上海雷磁?创益仪器仪表有限公司；NDJ-8S型数字黏度计，上海衡平仪器仪表厂；SZD-2型智能化散射光浊度仪，上海棱谱仪表有限公司；ScientificIndustriesVortexGenie2多用途旋涡混合器，美国ScientificIndustries公司；DHG-A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；SKEH超声波清洗器，南京科尔仪器设备有限公司；SHA-CA恒温水浴振荡器，金坛市盛兰仪器制造有限公司；HH-S恒温水浴锅，江苏国胜实验仪器厂。
1.2材料
脉络宁生产废水，金陵药业股份有限公司，废水组成包括清洗、提取、醇沉等工艺的生产废水，批次；对照品绿原酸（质量分数99.3%，批号-）、没食子酸（质量分数89.9%，批号-），中国食品药品检定研究院；甲醇，色谱级，德国默克公司，批号；甲酸、硫酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠、碳酸钠、二水合钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、溴水均为分析纯；BCA蛋白浓度测定试剂盒，北京索莱宝科技有限公司，批号；淀粉含量检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；果胶，质量分数74.0%，上海麦克林生化科技有限公司，批号C；咔唑，质量分数96%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号；干酪素，上海源叶生物科技有限公司，批号H29A7A。
2方法与结果
2.1样品预处理
取金陵药业获得的脉络宁注射液生产废水在r/min条件下离心5min，去除溶液中的固体微小颗粒，备用。
2.2超滤液制备
由于超滤系统会存在一定量的死体积，因此，超滤前需要对超滤系统进行平衡，取上述“2.1”项中3份离心液（每份2L），根据本实验室前期预实验对工艺参数研究的结果，用截留相对分子质量为的中空纤维膜进行超滤，超滤过程控制温度35℃，错流压差为10psi（1psi＝6.kPa），进料体积流量为mL/min。膜过滤30min后开始收集渗滤液，在超滤液体积为原体积的1/4（V1/4）、1/2（V1/2）、3/4（V3/4）3个超滤点分别取样，并测定超滤液中绿原酸和共性高分子的含量，以确定超滤过程的合适停止时间。
2.3膜型号优选工艺
依据“2.2”项下的条件，分别采用截留相对分子质量为、、的中空纤维膜对离心液进行超滤，并测定超滤液中绿原酸与共性高分子的含量，以确定超滤过程所使用的截留相对分子质量的中空纤维膜。
2.4有效成分含量测定
脉络宁注射液为南京金陵制药厂的主要产品，但主要为春秋两季生产，本实验所取批次为，处于其春季生产高峰期，实验前随机抽取5批脉络宁注射液，依据文献与现有标准[10-13]进行考察，结果显示脉络宁注射液中绿原酸、肉桂酸等8种主要成分含量稳定，说明脉络宁注射液在生产过程中稳定性较好。
鉴于脉络宁注射液生产废水中小分子药效成分以绿原酸为主，其他小分子药效物质咖啡酸、β-蜕皮甾酮等含量甚微，本研究选择绿原酸为富集目标考察成分。
2.4.1色谱条件ZorbaxSB-C18Agilent色谱柱（SUCL），以甲醇-0.2%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱：0～10min，5%～15%甲醇；10～20min，15%～32%甲醇；20～35min，32%～50%甲醇；35～45min，50%～70%甲醇；45～65min，70%～90%甲醇；65～66min，90%～5%甲醇；检测波长nm，体积流量1mL/min，进样体积10μL，柱温30℃。色谱图见图1。
2.4.2对照品溶液的制备精密称量绿原酸对照品0.25、0.50、0.89、1.00、2.00、3.46mg置于10mL量瓶中，加%甲醇定容至刻度线，摇匀，配制成绿原酸质量浓度分别为25.0、50.0、89.0、.0、.0、.0μg/mL的对照品溶液，过0.22μm滤膜，即得。
2.4.3线性关系考察以“2.4.2”项中制备的系列对照品溶液，按“2.4.1”项色谱条件进样分析，以峰面积积分值（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得出绿原酸回归方程为Y＝X－.09，r2＝0.，线性范围为25.0～.0μg/mL。
2.4.4样品测定精密量取废水样品（原液与渗透液）1mL过0.22μm滤膜（视样品测得浓度，可进行适当比例稀释），即得。
2.5高分子物质定量测定
2.5.1淀粉含量测定参照文献报道[14]，依据试剂盒的测试方法，量取样品与葡萄糖对照品0.2mL［样品吸光度（A）值需在线性范围内进行测定，依照情况进行稀释，葡萄糖对照品以10mg/mL的质量浓度稀释至0.01～0.50mg/mL］，按照蒽酮-硫酸比色法进行操作，在nm波长下测定A值，以A为纵坐标，葡萄糖质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。计算得回归方程A＝8.C＋0.，r2＝0.，线性范围为0.01～0.50mg/mL。
2.5.2果胶含量的测定参照文献报道[15]，量取样品与果胶标准品各0.2mL，按照咔唑比色法进行操作，最后在nm处以空白试剂作为参比，测得A值，以A为纵坐标，果胶质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。计算得回归方程为A＝2.C＋0.，r2＝0.，线性范围为0.～1.mg/mL。
2.5.3蛋白质含量的测定按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作加入标准品，并以二倍稀释法加入样品20μL，然后各孔加入μLBCA工作液，37℃放置15～30min，在nm波长下用酶标仪测定A值，并以A值为纵坐标，BSA质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。计算得回归方程A＝0.C＋0.，r2＝0.，线性范围为0.1～0.5mg/mL。
2.5.4鞣质含量的测定参照《中国药典》年版四部[16]鞣质含量测定方法，以没食子酸的紫外吸收标准曲线分别测定总酚量与不被吸收的多酚量，二者相减计算得出供试品中鞣质含量；另取废水30mL按照药典说明进行操作，制备供试品溶液。由没食子酸对照品溶液测定得到回归方程为A＝0.C＋0.，r2＝0.，线性范围为2.08～20.80μg/mL。
2.6膜优化工艺考察指标
计算超滤过程中绿原酸的透过率和共性高分子的平均截留率，综合评价超滤效果，综合透过率为超滤过程中相应的超滤点绿原酸整体透过率。
透过率＝C1/C0
C1为渗透液中绿原酸质量浓度，C0为原液绿原酸质量浓度
截留率＝1－C1′/C0′
C1′为渗透液高分子物质（淀粉、果胶、蛋白质、鞣质）质量浓度，C0′为原液高分子物质质量浓度
2.7膜过滤停止时间考察
测定3个超滤点（V1/4、V1/2、V3/4）的截留率和透过率。由表1可以看出，膜分离技术对于脉络宁注射液的生产废水中的共性高分子物质存在良好的截留作用，并且对于绿原酸有较好的富集作用，同时可知在过滤原液体积为3/4时有较为良好的结果，即膜过滤反应进程需要在此时停止。
2.8膜型号优选
测定经过不同截留相对分子质量中空纤维膜超滤后的截留率和透过率。由表2可以看出，各截留相对分子质量的中空纤维膜对于共性高分子均具有良好的截留作用，并且截留相对分子质量为的膜对于共性高分子物质的截留和绿原酸的透过更为优良，即在实验过程中选用的膜更为恰当。
2.9膜超滤工艺优化
2.9.1响应面试验设计根据影响中药水提液超滤效果的主要影响因素[17-19]，本实验以过膜温度（A）、错流压差（B）和过膜速率（C）为自变量，以绿原酸透过率和高分子截留率为响应值，采用综合评分（Y）评价超滤工艺。在膜过滤工艺评价的过程中，考虑到绿原酸透过率与高分子截留率均为重要评价指标，故予其相同的权重，由此制定的评分标准为Y＝绿原酸透过率×0.5＋高分子截留率×0.5（多种高分子的截留率以其平均值计算，各物质权重相等）。星点设计的因素水平见表3（因素水平综合考虑中空纤维膜的操作条件，其承受压力上限，压力与进料速率呈相关性，以及温度上限），对各试验药液按表3工艺条件进行膜超滤实验，结果见表3。
使用ANOVA分析响应面的回归参数，由表4结果可知，一次项A＜C＜B，各因素与Y的线性关系显著；二次项B2对曲线效应影响最大，利用Design-Expert8.0.6软件对表3数据进行多元回归拟合，得到Y对于A、B和C的二次多元回归方程Y＝84.74＋1.66A＋2.39B＋1.79C－2.42AB－2.64AC－1.78BC－3.57A2－7.69B2－1.37C2，该方程的相关系数r2＝0.。并且由表4方差分析结果可知，实验所选用的模型差异显著（P＜0.05），表明该二次多元方程比较显著，失拟项为0.＞0.05，表明失拟不显著；拟合程度良好，拟合误差较小。此外，该模型的变异系数（CV）为3.62%＜5%，属于可接受范围内。
2.9.2膜超滤工艺的响应面分析与优化采用Design-Expert软件，从3个变量中随机选出2个固定为中值，将因变量Y与另2个因素拟合成三维曲面图，以拟合目标函数为数学模型，绘制出因变量曲面图，见图2。确定的中空纤维膜对脉络宁注射液废水的最佳超滤工艺为过膜温度34.75℃，进料速率为.83mL/min，错流压差为15.44psi。结合实际情况，将超滤工艺条件修正为过膜温度35.0℃，进料速率为mL/min，错流压差为15.0psi。在共性高分子截留率中，影响因素A＞B＞C，并且与温度呈负相关性；在绿原酸透过率中，影响因素A＞B＞C，在一定程度上，升高A、B、C，绿原酸透过率初始曲线存在上升趋势，并且在温度与速率一定时，绿原酸透过率与错流压差存在“∩”型关系（图3）。
2.10工艺验证
按照上述“2.9.2”项的修正结果进行工艺验证（实验3次），结果见表5，脉络宁注射液生产废水的绿原酸透过率为（91.±0.）%，高分子截留率为（80.±2.）%，综合评分为（85.±1.）%（预测值为85.%），RSD为0.46%。验证实验结果与理论值偏差较小，说明该实验所得到的数学模型可靠，其工艺参数准确可信，具有良好的预测性。
2.11膜超滤前后废水物理化学参数的变化
考虑到废水液体的基本性质，对于废水过膜前后，分别取样50mL（重复3次）进行了一些物理化学参数的检测。由表6和图4可以看出，生产废水在经过超滤膜的精制作用后，溶液的浊度值得到大幅度的降低，表明液体的不溶解物质多数被中空纤维膜所截留；溶液的黏度、电导率、pH值等物理性质降低幅度较小，表明物质溶液环境没有受到太大的影响。
3讨论
本实验使用聚醚砜材质的截留相对分子质量为、、的中空纤维膜对脉络宁注射液生产废水进行精制。以绿原酸透过率及共性高分子截留率为指标，实验表明截留相对分子质量为的膜型号具有最佳的截留效果。植物中的共性高分子主要有蛋白质、果胶、鞣质、淀粉等组成，其相对分子质量一般大于，是传统上认为的无效、致敏类成分，从实验结果中可以看出，膜超滤过程作用于共性高分子有着优良的截留作用。
在绿原酸的定量测定中，对其方法学进行了考察，线性关系为Y＝X－.09，r＝0.，精密度、稳定性、重复性及加样回收率的实验结果RSD均小于2.0%，确保了工艺研究结果的可靠性。
共性高分子截留率受温度影响最大，根据Darcy定律[20]，温度影响着共性高分子的黏度，黏度与截留率呈正相关性，因此温度越高，黏度越小，而共性高分子截留率越小；与之对应的，以绿原酸为代表的小分子物质在温度越高时，其透过率随之提高。其次，本实验中，随着错流压差的由小逐渐增大，其透过率由线性增大逐渐平缓，并且当超过临界压力时，由于膜污染速度加快，透过率反而呈现下降趋势，因此，实际操作过程中需要选取一定温度与临界之下来运行才能保证良好的截留率与透过率[17]。
在本实验中，生产废水与超滤过程有着较好的适应性，同时发现随着膜使用时间延长，膜通量呈现出下降趋势，即膜污染问题较为突出，结合本课题组前期研究与本实验结果分析，膜污染的主要物质为果胶与淀粉[21-22]，在经过清洗之后，膜通量能恢复98.23%以上[23]，能有效的提高与延长中空纤维膜的使用寿命。
目前，中药废弃物的综合利用开发尚处于起步发展阶段，当前研究利用范畴比较狭窄，主要围绕着农业、畜牧业等上游产业，本研究基于现代分离技术，以实现“变废为宝”的多途径、多层次综合利用为目的，探索成本可控的中药废弃物资源化循环利用经济模式，提升资源利用效率，促进中药资源产业化过程中由传统工艺向生态工艺转化，实现中药资源产业的可持续发展。后续将围绕探索如何来降低生产成本以及提高脉络宁注射液生产废弃物的资源利用度来展开实验，为实现“绿色制造”提供可行方案。
参考文献（略）
来源：聂林峰，*佳云，何成华，朱华旭，段金廒，邢卫红，郭立玮，李博，潘永兰，汤卫国.膜技术富集脉络宁注射液生产废水中小分子药效成分的工艺优化研究[J].中草药,,50(8):-.
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