*萎病主要由土壤真菌*萎病引起，可严重降低棉花产量和品质。棉花抗*萎病的复杂机制仍不清楚。之前的研究中，对抗虫和感病棉花品种的根进行了蛋白质组学分析，发现了早期差异表达的蛋白质（GhRbohD）。然而，GhRbohD介导的ROS在棉花防御大丽花病*中的作用需要进一步研究。
郑州大学研究团队在MDPI发表了一篇名为“TheRespiratoryBurstOxidaseHomologProteinD(GhRbohD)PositivelyRegulatestheCottonResistancetoVerticilliumdahliae”的文章揭示了呼吸爆发氧化酶同源蛋白D(GhRbohD)积极调节棉花对大丽轮枝菌的抗性。
在本研究中，我们在体外和体内分析了GhRbohD介导的棉花抗大丽花病*的功能。qRT-PCR检测表明，GhRbohD沉默棉花抗性相关基因表达水平下调，主要涉及木质素代谢途径和茉莉酸信号途径。然而，GhRbohD的过度表达增强了转基因拟南芥对大丽花弧菌的抗性。此外，应用Y2H分析发现GhPBL9和GhRPL12C可能与GhRbohD相互作用。这些结果强烈支持GhRbohD激活活性氧的产生，以积极调节植物对大丽花的抗性。
为了进一步阐明GhRbohD对棉花植物*萎病抗性的影响，我们监测了六个抗性相关基因的表达，结果表明这些抗病相关基因的表达水平在GhRbohD沉默的植物中普遍受损（图5）。作为木质素代谢途径的关键基因，与对照相比，沉默的GhRbohD植物中碱性几丁质酶(GhCHI)、苯丙氨酸解氨酶(GhPAL5)和肉桂酸羟化酶(GhC4H1)的基因表达显着下调。详细地，GhCHI的表达在9hpi时达到谷值，仅为对照的五分之一左右，与GhPAL5的表达相同。此外，在GhRbohD沉默的植物中，抗性相关基因3（GHPR3）和超敏标记基因（GhHIN1）的表达也受到不同程度的抑制，尤其是在9hpi后，保持稳定水平。作为茉莉酸通路的重要基因，GhJaz1的表达继续下降。
图5.抗病基因在GhRbohD沉默和对照植物中的表达
为了进一步证明这两种蛋白质与GhRbohD之间的相互作用，我们验证了相互作用蛋白质。首先，将目的蛋白、阳性对照、阴性对照和相互作用蛋白共转化到酵母培养基DDO（SD/-Leu-Trp）中，观察菌落生长情况。然后在酵母培养基QDO(SD/-Leu-Trp-His-Ade)上验证了相互作用蛋白的酵母旋转实验，在10-1、10-2和10-3酵母液的稀释液可观察到GhPBL9与GhRbohD、GhRPL12C和GhRbohD之间的相互作用（图8）。这些结果表明GhPBL9和GhRPL12C可能与GhRbohD相互作用，并且GhRPL12C和GhRbohD之间的蛋白质相互作用强于GhPBL9和GhRbohD之间的蛋白质相互作用。
图8.GhRbohD与GhPBL9和GhRPL12C相互作用的酵母双杂交分析
在这项研究中，GhRbohD沉默的棉花植株的ROS产生、NO、H2O2和Ca2+含量显着降低。此外，表达谱分析显示GhCHI、GhPAL5、GhC4H1和GhJaz1显着下调，涉及木质素代谢和茉莉酸信号通路。进一步研究表明，过表达的拟南芥表现出更强的抗性。总之，这些结果提供了GhRbohD介导ROS产生作用的证据，证实了GhRbohD在植物中对大丽花的正调节作用。
