白癜风治疗效果好的医院 https://disease.39.net/bjzkbdfyy/250423/c3vfdi8.html一、目的要求
学习果蔬组织中苯丙氨酸解氨酶活性的测定原理和方法。
二、基本原理
苯丙氨酸解氨酶（Phenylalamineammonialyase，PAL）是许多植物次生物质（如黄酮类物质、酚类物质、木质素和水杨酸等）生物合成途径——苯丙烷代谢的关键酶，与植物的抗逆境胁迫和抗病性密切相关，在植物的正常生长发育和抵御病原菌侵害过程中起着重要作用。
PAL催化L-苯丙氨酸裂解脱氨反应，形成的产物反式肉桂酸化合物（trans-cinnamicacid）在nm处有最大光吸收值。该酶活性的变化可以根据其催化形成的产物反式肉桂酸在nm吸光度值变化进行测定。在1cm光程下当吸光度值变化0.01，就有1μg反式肉桂酸量的变化。若酶的加入量适当，反应体系在波长nm处吸光度值的升高速率可在几小时内保持不变。
三、材料、仪器及试剂
（一）材料
梨、苹果、马铃薯。
（二）仪器及用具
高速冷冻离心机、研钵、紫外分光光度计、计时器、移液器、离心管、容量瓶（mL、20mL、0mL）、试管、水浴锅。
（三）试剂
1．mmol/L、pH8.8硼酸缓冲液
母液A（50mmol/L硼砂溶液）：称取19.07g硼砂（十水合硼酸钠），用蒸馏水溶解、定容至0mL。
母液B（mmol/L硼酸溶液）：称取12.73g硼酸，用蒸馏水溶解、定容至0mL。
取66.67mL母液A和33.33mL母液B混合后，调节pH至8.8，稀释至mL。
2．50mmol/L、pH8.8硼酸缓冲液
3．提取缓冲液（含4%PVP、2mmol/LEDTA和5mmol/Lβ-巯基乙醇）
取4gPVP、58mgEDTA，35μLβ-巯基乙醇，加mmol/L、pH8.8硼酸缓冲液溶解、定容至mL，低温（4℃）保存备用。
4．20mmol/LL-苯丙氨酸溶液
称取mgL-苯丙氨酸，用50mmol/L、pH8.8硼酸缓冲液溶解、定容至mL。
5．6mol/L盐酸溶液
取10mL浓盐酸溶液，稀释到20mL。
四、实验步骤
（一）酶液制备
称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆。将匀浆液全部转入到离心管中，于4℃、10×g离心30min，收集上清液，即为粗酶提取液，低温保存备用。
（二）活性测定
方法一：取两支试管，都分别加入3.0mL50mmol/L、pH8.8硼酸缓冲液、0.5mL20mmol/LL-苯丙氨酸。向一支管中加入0.5mL酶提取液，另一支管中加入0.5mL经煮沸5min的失活酶液作为对照。然后，将两支反应管置于37℃保温60min。保温结束时立即向两支反应管中分别加入0.1mL6mol/L盐酸溶液以终止反应。以蒸馏水为参比空白调零，分别测定样品反应管和对照反应管中溶液在波长nm处的吸光度值（OD1和OD0）。重复三次。
方法二：取1支反应管，加入3mL50mmol/L、pH8.8硼酸缓冲液和0.5mL20mmol/LL-苯丙氨酸，在37℃预保温平衡10min，再加入0.5mL酶液，混合后，迅速测定一次该混合液在波长nm处的吸光度值作为反应的初始值（OD0）。然后将反应管置于37℃保温60min。保温结束时再立即测定一次反应混和液在波长nm处的吸光度值作为反应的终止值（OD1）。注意均以蒸馏水作为参比空白进行调零。根据保温前后样品管溶液吸光度值的变化，可计算PAL活性。重复三次。
五、实验结果与计算
1．将测定的数据填入下列表
2．计算结果
根据反应液的吸光度值差值（OD1-OD0），计算苯丙氨酸解氨酶活性。以每小时每克鲜重（FW）果蔬组织反应体系吸光度值增加0.01时为1个PAL活性单位（U），表示为0.01△OD·h-1·g-1FW。计算公式：
式中：
OD1——样品管反应溶液的吸光度值或保温前反应液的初始值；
OD0——对照管反应溶液的吸光度值或保温后反应液的终止值；
V——样品提取液总体积，mL；
Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；
t——酶促反应时间，h；
W——样品重量，g。
六、注意事项
1．原装β-巯基乙醇的摩尔浓度大约为14.3mmol/L；EDTA的相对分子质量为.25；L-苯丙氨酸的相对分子质量.19；浓盐酸摩尔浓度为12mmol/L。
2．加入聚乙烯砒硌烷酮（PVP）或PolyclarAT，以除去酚类物质多酶活性的影响，并防止其对吸光度值的干扰。
3．也可以每小时使反应体系在nm吸光度值增加0.01所需的酶量为1个苯丙氨酸解氨酶活性单位（U），表示为0.01△OD·h-1·mg-1蛋白质。另外，根据反式肉桂酸在nm吸光度值标准曲线，可用酶促反应产物反式肉桂酸生成量来表示PAL酶活性。
