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TUhjnbcbe - 2025/4/26 21:02:00

一、原理

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonialyase,PALase)催化苯丙氨酸的脱氨反应,使NH、释放出来形成反式肉桂酸。此酶在植物体内次生物质(如木质素等)代谢中起重要作用。根据其产物反式肉桂酸在nm处吸光度的变化可以测定该酶的活性。

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料马铃薯块茎。

(二)仪器设备

紫外分光光度计,离心机,研钵,吸滤瓶,红光装置,打孔器。

(三)试剂

(1)0.05mol/L硼酸盐缓冲溶液(pH8.8)。

(2)0.02mol/L苯丙氨酸(用0.1mol/LpH8.8硼酸缓冲液配制)。

(3)5mmol/L巯基乙醇硼酸缓冲液。

三、实验步骤

1.马铃薯圆片制备

将马铃薯块茎洗净、削皮,用打孔器(直径1.5cm)取圆柱,切除两头近表皮处,中间部分切成2mm厚的圆片。先用自来水漂洗,最后用蒸馏水洗一次,用纱布吸干表面的水。2.光诱导

将国片平铺在湿润滤纸的培养皿中,置20~30℃红光下处理24h以诱导PAL(也可接种病原菌诱导等)。

3.酶粗提液的制备

经诱导处理的马铃薯圆片5g,加10mL含5mmol/L的巯基乙醇硼酸缓冲液、0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或PolyclarAT(除去酚类物质毒害,防止酮颜色的干扰)、少量石英砂在研钵中研磨。匀浆抽气过滤,滤液在r/min离心15min,上清液为酶粗提液。上述操作均在0~4℃下进行。

4.酶活性测定与计算

1mL酶液加1mL0.02mol/L苯丙氨酸,2mL蒸馏水,总体积为4mL。对照不加底物,多加1mL蒸馏水。反应液置恒温水浴30℃中保温,0.5h后用紫外分光光度计在nm处测定吸光度。以每小时在nm处吸光度变化0.01所需酶量为一单位(相当每毫升反应混合物形成1μg肉桂酸)。

蛋白质含量用斐林-酚法进行测定。

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