参考文献：LuoShunbin,XieLingping,ChenJingjingetal.ScrophularianingpoensisHemsl.DeterminationandPharmacokineticProfilesofFourActiveComponentsFrominRats.[J].FrontPharmacol,,11:.
文献IF：5.81
前言
玄参，长期以来一直用于中医（TCM）。主要用于治疗阴虚发热、红舌过度口渴、剧烈发热致斑、结膜充血、咽痛、阴囊、白喉等疾病。玄参，中国药典（年版）中记录了其抑制癌细胞增殖的能力。许多研究报告了玄参的主要生物活性成分的各种生物效应，即毛蕊花糖苷，安格洛苷丙，哈巴俄苷和肉桂酸（图1）。由于生物活性成分决定了中医的临床效果，因此研究来自玄参的四种活性成分的药代动力学并确定作用机制非常重要。这种鉴定为临床实践中的实验提供了有效的依据。
最近，越来越多的分析方法用于表征和测定生物体液中的毛蕊花糖苷，安格洛苷丙，哈巴俄苷和肉桂酸。这些检测方法仅测定了一种或两种主要生物活性成分。没有一种报道的方法同时检测到生物体液中宁波*芩的四种主要活性成分。由于药代动力学信息对于优化临床剂量非常重要，因此必须开发一种快速，简单和灵敏的分析方法，以同时检测和药代动力学评估大鼠血浆中玄参的各种生物活性成分。UPLC-MS/MS在分析技术方面提供了许多进步，通常用于环境，生物分析和药物研究。因此，我们开发了一种高度坚固，快速和选择性的UPLC-MS/MS方法来测定大鼠血浆中毛蕊花糖苷，安格洛苷丙，哈巴俄苷和肉桂酸的浓度。我们通过蛋白质沉淀处理了μL大鼠血浆，这提供了更好的效果和更少的基质效应。在这项工作中，利用该方法节省的时间，高灵敏度和低基质效应研究了玄参的四种活性组分的药代动力学。
1.方法
1.1UPLC-MS/MS条件
在超高效液相色谱（UPLC）装置上通过AcquityBEHC18色谱柱（2.1×50mm，1.7μm）和在线0.2μm不锈钢色釉过滤器分离分析物。在梯度程序下使用结合流动相A（乙腈）和流动相B（水中0.1%甲酸）的流动相：0-0.4分钟（10-10%A），0.4-0.8分钟（10-90%A），0.8-2.0分钟（90-90%A）和2.0-2.1分钟（90-10%A）。后运行时间设置为1.9分钟。将6μL进样体积加入UPLC系统中，其中流速，色谱柱温度和自动进样器温度分别为0.40ml/min，40℃和10°C。
来自玄参的四种活性成分通过配备电喷雾电离（ESI）源的XEVOTQD三重四极杆质谱仪在负离子监测模式下检测。前体-产物离子跃迁为毛蕊花糖苷m/z.4→.3，安格洛苷丙为m/z.5→.0，哈巴俄苷为m/z.3→.2，肉桂酸为m/z.2→.4，IS为m/z.4→.1。仪器控制和数据采集是在Masslynx4.1软件上进行的。
1.2标准溶液、校准标准品和质量控制样品
将储备溶液（1.00mg/ml）用甲醇稀释，以制备玄参活性组分和IS的标准工作溶液。校准标准溶液用无药血浆以以下浓度稀释：10，20，50，，，，和1，ng/ml。QC样品也以相同的方式制备至20，和ng/ml，乙腈中的IS为ng/ml。在分析之前，将制备的标准工作溶液储存在-80°C的冰箱中
1.3样品制备
我们在乙腈（ng/ml）中制备了μLIS工作溶液，并在将μL血浆样品解冻至室温后加入1.5ml离心管中。将管子涡旋混合1.0分钟，并在13，×g的离心机中旋转10分钟。收集上清液（μL），并将6μL注入UPLC-MS/MS系统进行分析。
1.4方法学考察
运行血浆样品，QC样品和校准标准溶液以评估其特异性，回收率，基质效应，准确度和精密度以及稳定性。
通过比较不同批次的空白血浆和相应的加标血浆色谱图，研究了该方法的特异性，以确保样品中的内源性和其他物质不会干扰分析物和IS分析。
校准曲线由分析物与IS的峰面积比与分析物的标称浓度进行比较。LLOQ被定义为校准曲线上的最低浓度，其中信噪比（S/N）至少为10。计算相对标准差（RSD%）和相对误差（RE%）分别作为精度和准确度的度量。校准曲线数据准确性和精度的验收标准分别为LLOQ标称浓度的80-%和标称浓度的20±20%。
为评估日内及日间的准确度及精密度，在一天或连续三天内检出三种不同浓度的QC样本（20、及ng/ml）。目标RSD%和RE%在±15%以内。
我们获得并使用了三种不同的加工QC样品来评估分析物的提取回收率和基质效应。我们比较了从血浆中提取的样品的峰面积（A），后提取的空白血浆加标样品（B）和相应的纯参考标准溶液（C），其中A/B定义为提取回收率，B/C被认为是基质效应。
为了评估分析物的稳定性，我们在不同的储存和工艺条件下（室温4小时，?80°C49天，从-80°C到室温的三次冻融循环，在10°C的自动进样器中从10°C的自动进样器中分析了三种不同浓度（n=5）的QC样品。
1.5药代动力学研究
从温州医科大学（中国浙江）实验动物中心获得的雄性Sprague-Dawley大鼠（-克）被给予免费的水和标准大鼠颗粒。适应期过后，大鼠为研究做准备。我们发现混合物中每种物质的剂量为3.0mg/kg适合在初步研究中研究药代动力学趋势。所有实验程序和方案均根据美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行，并在研究开始前获得温州医科大学动物护理和使用委员会（wydw-2）的批准。
在实验前，笼中大鼠禁食12小时，但允许浇水。从尾静脉收集的全血样品（0.3ml）在舌下静脉内施用含有毛蕊花糖苷，安格洛苷丙，哈巴俄苷和肉桂酸（3.0mg/kg）：0.，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4和6小时的混合物后，在以下时间点放入相应的肝素化聚乙烯管中。我们在实验开始后2小时向大鼠加注2ml盐水溶液，以减少动物的痛苦。将全血（μL）在以4，g离心8分钟后，将血浆（μL）分离到1.5ml离心管中。将血浆浓度与时间的关系数据导入DAS2.0软件（药物与统计学软件，上海中医药大学药物临床研究中心，中国上海）中，计算来自玄参的四种活性组分的药代动力学参数。
2.结果与讨论
2.1方法开发和优化
样品提取在灵敏度和可靠性方面起着关键作用，是生物分析的重要因素。蛋白质沉淀在这项研究中节省了时间，简单，低基质效应和高回收率。我们尝试了几种有机溶剂，包括乙腈，甲醇以及不同比例的甲醇和乙腈，但由于性能良好，我们选择了μL乙腈作为沉淀剂。
为了获得更好的色谱行为和电离效果，我们尝试了许多不同比例（含或不联合甲酸铵或甲酸）的色谱柱和流动相。我们采用了由乙腈和0.1%甲酸组成的流动相。与其他色谱柱（如AcquityUPLCHSSC18色谱柱（2.1×mm，1.8μm）相比，具有梯度洗脱的沃特世AcquityUPLCBEHC18色谱柱（2.1×50mm，1.7μm）具有更好的峰对称性、适当的分析时间和更少的基质效应。在所选条件下，整个分析时间为4.0分钟。
2.2方法验证
分析物和IS的代表性色谱图没有明显的干扰（图2）。毛蕊花糖苷、安格洛苷丙、哈巴俄苷、肉桂酸和IS保留时间分别为1.59、1.61、1.67、1.76和1.62min。
LLOQ为10ng/ml的方法在分析物的浓度范围为10-0ng/ml时呈线性关系。所有校准曲线的相关系数均大于0.99。
表1中列出的结果显示，分析物RSD的范围为2.6%至11.5%。相应的RIE范围为?9.6%至10.7%，RSD和RE在可接受的限度内。分析物回收率和基质效应范围分别为76.7~87.1%和92.9~.4%。
根据FDA验收标准，分析物在不同的储存和处理条件下（室温4h，?80°C49天，从-80°C到室温的三次冻融循环，以及在10°C的自动进样器中48h）下保持稳定（表2）。总之，该方法可用于研究大鼠中猪笼草的四种活性成分的药代动力学特征。
3.2药代动力学研究
我们建立了以紫杉叶素为IS的UPLC-MS/MS方法，并将其应用于舌下静脉下注射混合物（3.0mg/kg）后大鼠中大鼠的四种活性成分（acteoside，angorosideC，harpagoside和肉桂酸）的药代动力学谱研究。采用非室谱模型计算了浮雕甙、安哥拉甙C、哈帕戈苷和肉桂酸的药代动力学特征。4种活性组分的平均血浆浓度-时间曲线和主要药代动力学参数分别见图3和表3。
主要中药成分在舌下静脉内给药后逐渐代谢和排泄。药物在体内的代谢和排泄由药代动力学参数描述，如清除率（CL），半衰期（t1/2）和平均停留时间（MRT）。在玄参的四种活性成分中，哈巴俄苷具有最大的CL，但其t1/2、MRT和曲线下面积（AUC）最小。相反，肉桂酸CL是最小的，但它的t1/2和AUC是最大的。毛蕊花糖苷和安格洛苷丙药代动力学参数介于最大值和最小值之间。表观分布量（Vd）可以粗略地用于推断药物在体内的分布和组合。哈巴俄苷有最大的Vd，而毛蕊花糖苷有最小的Vd。当t1/2而MRT通常较短，药物代谢和排泄相对较快，理论上Vd应相对较小。由于整个身体是一个复杂的系统，这些差异的存在需要通过进一步的研究来证实。
3.结论
开发出一种简单、快速、灵敏的UPLC-MS/MS方法，在舌下静脉下给药后同时测定大鼠中玄参（毛蕊花糖苷，安格洛苷丙，哈巴俄苷和肉桂酸）的四种活性成分。该方法在药代动力学研究中得到了验证。用乙腈处理样品进行蛋白质沉淀，色谱分离仅需4.0min。明确中药主要活性成分的药代动力学特性，对于准确治疗临床疾病具有重要意义。它通过研究主要生物活性成分的药代动力学和确定作用机制，为临床实践提供了有效的实验基础数据。如果本研究能与药效学研究相结合，对中药主要活性成分，不仅可以避免中药中其他成分引起的副作用，还可以为中药临床疾病的精准治疗提供科学指导。
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